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可得然胶发酵生产的关键性因素

2018/3/19 10:08:47      点击:

摘要:本文针对可得然胶发酵生产过程中影响非常显著的几个关键性因素:包括作为发酵生产基础的生产菌代谢机理和发酵规律以及 pH 调控策略、接种量与接种时间、碳氮比、发酵过程物质传递效率等进行了分析总结。得出了可得然胶发酵生产研究需要解决或是着重关注的几点因素:一是可得然胶两阶段发酵的规律性特点,氮源的种类与添加量是最关键性因素;二是 pH 分阶段控制策略的提出与研究方向;三是接种量与接种时间、碳氮比及发酵过程物质传递效率优化改进的研究方向。总之,可得然胶发酵生产环节技术水平提高的空间仍然较大,需要进行更多的研究来不断的改进和完善。
 

1 前言

可得然胶(Curdlan)是由微生物发酵糖质原料而产生的一种新型胞外多糖,由于其具有在加热条件下形成凝胶的独特性质,所以又被称作热凝胶。可得然胶的化学结构分析表明它是由单一的 D-葡萄糖在 C1和 C3位置以 β-1,3-糖苷键连接而成的无分支的均一多糖聚合物,属于 β-1,3-葡聚糖家族中较为特殊的一种。 可得然胶的分子式为(C6H10O5)n,n>250。可得然胶具有在加热条件下形成凝胶的独特性质, 且在不同的温度阶段形成的凝胶具有不同的性质,在温度为 54-60℃范围内,可得然胶能够形成一种可逆的低强度凝胶(low-set gel);而当温度升至80℃以上时,可得然胶又将形成另外一种不可逆的、高弹性的高强度凝胶(high-set gel)。

基于这样的性质,目前可得然胶的主要用途是在食品工业上,用以提高食品的品质或赋予其一定的特性。1989 年后,可得然胶在日本、韩国以及台湾地区已成为一种重要的食品添加剂并得到广泛的使用。1996 年 12月, 美国 FDA 经过长期的安全性及食品毒理学检测,证明了可得然胶用于食品中是安全的,批准其作为食品添加剂按生产需要适量添加。 可得然胶成为继黄原胶、结冷胶之后第 3 个被 FDA 批准的由微生物发酵生产的可食用多糖。

我国对可得然胶的研究与生产起步虽然较晚,但在相关研究机构和企业的不懈努力下, 涉及可得然胶生产瓶颈技术取得了突破性进展,并在 2011 年实现了可得然胶的产业化, 其产品质量可与进口的相媲美。 可得然胶的独特性质使其具有广阔的食品消费市场, 随着在食品工业应用技术的逐渐成熟和应用领域的不断扩大, 可得然胶的市场需求量将会激增,市场需求的放大必然带来产能的迅速提高,产能的提高又与生产规模及生产效率密切相关。 本文通过分析总结可得然胶发酵生产相关的研究成果及结合实际生产情况, 对可得然胶发酵生产过程中的关键性因素进行分析讨论, 希望能对国内可得然胶生产企业在发酵生产技术、 可得然胶产品品质方面的改善和提高以及生产成本的降低有所帮助。
 

2 可得然胶代谢途径与发酵规律

目前用于可得然胶生产的菌株一般为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis),为革兰氏阴性细菌。可得然胶是在菌体处于氮源限制条件下代谢合成的,其发酵过程在有氧环境中进行,使用发酵罐发酵。可得然胶的发酵生产过程是典型的菌体生长非偶联型发酵, 菌体在培养基中氮源耗尽后才开始合成可得然胶目的产物,所以可得然胶的发酵生产可分为两大阶段:(1)菌体生长,积累生物量阶段;(2)氮源耗尽,菌体代谢途径发生转变大量合成产物阶段。

Sutherland 等人提出了革兰氏阴性细菌合成可得然胶的代谢途径,主要分为三个步骤:(1)反应底物的吸收;(2) 生物酶催化细胞内单糖聚合为多糖;(3)多糖产物分泌到细胞外。UDP-Glucose 作为糖基载体是可得然胶合成的重要前体物质,其代谢途径有两条:参与多糖的合成或者是细胞壁脂多糖合成。 在氮源限制的胁迫条件下,为维持细胞自身的生存,菌体内的代谢调控系统在感知氮缺乏的信号后, 最佳调控策略是通过阻断用于细胞壁合成的脂多糖的合成而使细胞的增殖停止,从而大大减少菌体细胞对于氮源和能量的需求。同时环境胁迫的信号使菌体细胞代谢调控系统启动可得然胶合成代谢途径,使非生长状态下细胞内的能量(ATP→UTP→UDP-Glucose)转移并储存转化成可得然胶,而该调控使得 UDP-Glucose 绝大部分用于可得然胶的合成。

这 样 一 套 环境 胁迫-应激代谢途径转换的系统,正是一套完整的微生物环境适应系统,其作用从微生物生态学上讲是菌体以可得然胶的形式来储存碳源与能量来渡过氮源匮乏的不利环境, 从而大大增强了菌体细胞对环境的适应能力。类异戊二烯磷酸酯(Lipid-P)也称载体脂,是存在于微生物细胞膜内的糖基载体脂,其功能是将胞质内的糖基在其上聚合成多糖,携载多糖分子通过细胞膜运往膜外,载体酯在可得然胶的合成代谢途径中起到了关键性作用。另 外 ,细 胞 内 的 核 苷 酸不但是合成 DNA 的重要物质, 而且还可以调节菌体细胞的生长代谢。有研究报道通过绘制可得然胶合成与细胞内核苷酸含量水平的时间变化曲线发现,可得然胶的生物合成与菌体内的核苷酸水平呈正比关系。

为可得然胶分批发酵过程曲线,从菌体生长量曲线和多糖开始产生时间来看,可得然胶是在菌体生长进入稳定期后开始产生,同时培养基中的残糖含量开始迅速下降,实际研究结果与以上分析是一致的,即可得然胶的发酵过程分为两个相对独立的阶段。

由可得然胶发酵过程菌体生长代谢与产胶代谢规律特点可知:(1)可得然胶发酵过程中最为关键的是氮源的种类与含量,它直接决定发酵过程中的菌体生长速度和在氮源耗尽时菌体的最大生物量,进而决定最终的可得然胶产量;(2)菌体从生长阶段转变为多糖合成阶段有赖于对发酵体系的控制,参数包括 pH、搅拌转速、通气速率等。
 

3 pH

大量研究证实合成可得然胶的酶的最适 pH 在5.5-5.6,而 菌 体 生长的 适 宜 pH 则 在 7.0,如 何 在发酵生产过程中提供一个较为适宜的缓冲体系来满足可得然胶发酵过程中两阶段不同的 pH 要求是达到可得然胶高产稳产的关键性因素之一。

在可得然胶分批发酵生产过程中,一般采用初始 pH 为 7.0 的培养基,而后随着菌体的快速生长会产生大量的有机酸(甲酸、乙酸等)使发酵体系的 pH 迅速下降, 直到降至适合可得然胶大量合成的 pH 范围为止。这样一个 pH 降低的过程是非常有利于可得然胶发酵产生的:在 pH 从 7.0 下降至 5.5 的过程中, 菌体细胞内与可得然胶合成有关的三个关键酶活性均有显著提高, 同时可得然胶合成的关键性前体物质 UDP-Glucose、UTP 的生成量也显著提高,最终导致可得然胶产量的提高。

解决了发酵过程菌体生长阶段 pH 控制方法后, 在可得然胶目标产物合成期主要的任务是将发酵体系的 pH 维持在合成可得然胶酶的适宜 pH 范围,以保持可得然胶的合成始终处于高的合成效率。控制 pH 的方法一般有两种:一是采用一定 pH 的缓冲体系;二是通过流加一定浓度的酸或碱来控制。前者操作简便但是控制精度不够; 后者控制较为精确但是需要连续操作而且在大规模体系下误差也比较大。 这正是当前制约可得然胶生产规模扩大的一个重要因素,需要研究一套对大规模生产有效的、适宜两阶段 pH 特点的发酵控制体系, 从而大大提高可得然胶工业化生产的效率与生产规模。
 

4 接种量与接种时间

发酵接种量与发酵过程中底物的消耗速率、细胞生长速率有着密切的关系, 同时间接影响到发酵周期的长短和目的产物的产量。 过少的接种量势必导致菌体生长延滞期的延长,使发酵周期时间增加;但过多的接种量不仅会增加种子的制作成本, 还会导致菌体的过速生长,消耗大量的底物,从而影响目的产物的生成量。 可得然胶发酵生产由于是种子限氮培养转发酵, 这就要求接入的种子在发酵体系内氮源消耗殆尽时恰巧是菌体浓度与活力达到最高的对数生长末期,在此时转入可得然胶的发酵生产,以保证可得然胶的生产效率最大化。 浙江大学的李卫旗通过实验研究总结出可得然胶比较适宜的接种量为 10%,而山东大学董学前的实验结果表明5%是可得然胶发酵的理想接种量,由此可知发酵接种量与发酵菌株有直接关系。

接种时间即种龄直接关系到种子的活力, 一般选择处于对数生长中后期的种子为最佳。 与最适接种量和菌株相关相同的是利用不同的发酵菌株实验得到的最佳种龄也有显著差异。 有研究表明 10h 是比较合适的种龄, 而又有另外的研究证明 24h 是最佳的接种时间。
 

5 碳氮比

C/N的高低直接影响发酵前期菌体的生长速度: 高的 C/N 虽然有利于后期的发酵产能提高,但会在一定程度上抑制菌体的生长而延长发酵时间;而过低的 C/N 则使菌体生长速度过快,会消耗较多碳源,对于以 C 源为主要原料合成胞外多糖的可得然胶发酵来说是非常不利的,将直接导致多糖得率的显著降低。因而,合适的发酵初始 C/N 也是可得然胶发酵高产胶率、高转化率的重要因素之一。目前大部分研究报道的初始糖浓度都在 5.0-8.0%之间,转化率在 50-60%之间,可提高的空间仍然比较大。

针对可得然胶的两阶段发酵特点,在发酵过程中进行补料应该是一种提高发酵生产效率的有效手段。在菌体生长阶段采用适宜菌体生长的较低的 C/N, 而 后 在 氮 源耗尽 , 菌体转 入 多糖 合 成 途 径 后 ,向发酵体系内补充适宜浓度的碳源, 这将显著地提高多糖的得率,从而提高发酵生产效率。江南大学刘惠进行了葡萄糖连续流加实验,将发酵液中葡萄糖浓度维持在较低状态, 减少碳源的抑制效应对多糖产量造成的不利影响, 显著提高了可得然胶产量和碳源转化率, 结果可得然胶的得率最高达到 72g/L,比分批发酵增加了 157%,当然这仍然是实验室研究结果, 实际生产中进行连续流加操作成本较高, 不过可以考虑分阶段进行补料的方法, 即通过研究发酵过程选取其中比较适合的时间点进行补料发酵, 相信一定可以得到较为理想的发酵产率与转化率。
 

6 物质传递效率

与黄原胶、结冷胶等高粘性多糖的发酵生产对于物质传递的超高要求相比,可得然胶发酵生产过程中的传质阻力显然小了许多。但是,可得然胶的一个重要性质就是其水不溶性,这对其发酵生产具有显著的影响,在发酵生产过程中,包括可得然胶和菌体在内的固形物将会迅速积累,从而降低发酵体系内物质(主要是氧气和碳源)的传递效率和最终多糖的发酵得率。基于这样的原因,在发酵的中后期,需要对于发酵体系的物质传递效率进行重点关注,适当提高搅拌转速和通气速率是非常必要的,这有利于保持可得然胶快速的合成速率,有效缩短发酵时间以减少维持菌体生命活动的基质代谢消耗,从而使可得然胶的生产效率最大化。